ОЦЕНКА СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ГЕМОСТАЗА И МЕТАБОЛИЗМА ФОЛАТОВ В РАЗВИТИИ ОСЛОЖНЕНИЙ БЕРЕМЕННОСТИ

ВВЕДЕНИЕ

Комплекс гестационных осложнений, объединенных под термином «большие акушерские синдромы» (БАС), включающий преэклампсию, преждевременные роды, задержку внутриутробного развития плода и другие патологические состояния, представляет собой значимую проблему в современном акушерстве ввиду его существенного вклада в показатели материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. Патогенетические механизмы, лежащие в основе данных синдромов, характеризуются сложностью и мультифакторностью, что обусловлено взаимодействием генетической предрасположенности, факторов внешней среды и генотип-фенотипических взаимодействий между матерью и плодом [1].

Особую роль в развитии гестационных осложнений играют тромбофилические состояния и нарушения метаболизма фолатов, детерминированные генетическим полиморфизмом, оказывающие влияние на маточно-плацентарную перфузию и процессы метилирования [2][3]. В связи с этим настоящее исследование направлено на оценку совместного влияния генетических факторов, связанных с гемостазом и метаболизмом фолатов, на риск развития осложнений беременности, что позволит верифицировать группы риска с высокой степенью точности и разработать эффективные стратегии персонализированной профилактики гестационных осложнений.

Цель – определение факторов потенциального влияния генетических полиморфизмов генов системы гемостаза и метаболизма фолатов и их связи с развитием больших акушерских синдромов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование вошли 248 беременных женщин, наблюдавшихся в Сургутской городской клинической поликлинике № 1 и в Сургутском окружном клиническом центре охраны материнства и детства в период с августа 2022 г. по декабрь 2024 г. Основную группу составили пациентки с различными нозологическими формами БАС (n = 129), включая преждевременный разрыв плодных оболочек, преждевременные роды, преэклампсию и задержку развития плода. Контрольную группу сформировали условно здоровые беременные, не имеющие осложнений гестации.

До включения в исследование у всех участниц было получено письменное информированное добровольное согласие, одобренное локальным этическим комитетом Сургутского государственного университета (протокол № 04 от 12.07.2022). Все женщины подвергались комплексному клинико-лабораторному и инструментальному обследованию в условиях клинических учреждений.

Критериями исключения из исследования являлись: наличие инфекции вируса иммунодефицита человека; беременность, наступившая в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий; многоплодная беременность; наличие соматических и гинекологических заболеваний, оказывающих влияние на репродуктивную функцию, а также отсутствие информированного добровольного согласия.

Забор венозной крови у доноров и последующая обработка полученных образцов осуществлялись в соответствии со стандартными операционными процедурами, разработанными сотрудниками лаборатории и валидированными согласно рекомендациям, изложенным в Национальном руководстве по биобанкированию [4]. Транспортировка образцов цельной крови и ее дальнейшее аликвотирование производились в течение двух часов с момента забора при строгом соблюдении температурного режима (+4 °С). После аликвотирования образцы помещались на криохранение при температуре –80 °С в лаборатории «Биобанк Югры».

Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови осуществляли в ламинарном боксе 2-го класса II А «АМС–МЗМО» с использованием набора реагентов «ПРОБА-РАПИД» (ДНК-Технология, Россия) согласно протоколу производителя.

Молекулярно-генетический анализ. Идентификация однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов, ассоциированных с нарушениями в системе гемостаза и метаболизме фолатов, проводилась методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием коммерческих наборов «Генетика гемостаза» и «Генетика метаболизма фолатов» (ДНК-Технология, Россия). Генотипирование выполнялось по 12 полиморфным локусам: F2 – 20210Г/А, F5 – 1691Г/А, F7 – 10976Г/А, F13 – 103Г/Т, FGB – –455Г/А, ITGA2 – 807Ц/Т, ITGB3 – 1565Т/Ц, SERPINE1 – –6755Г/4Г, MTHFR – 677Ц/Т, MTHFR – 1298А/Ц, MTR – 2756А/Г, MTRR – 66А/Г.

Статистический анализ. Оценка межгрупповых различий в частотах аллелей проводилась посредством расчета относительной частоты (А) встречаемости полиморфизмов с использованием программного обеспечения Microsoft Excel (MS Office). Статистическая значимость различий частот в исследуемых группах рассчитывалась с использованием критерия χ² Пирсона. Результаты анализа считали статистически значимыми при уровне p < 0,05 [5]. Для оценки ассоциации между наличием ОНП и риском развития БАС рассчитывали относительный риск (RR) по формуле:

где а – количество пациенток с БАС, имеющих данный генотип; b – количество пациенток с БАС, не имеющих данный генотип; с – количество условно здоровых женщин, имеющих данный генотип; d – количество условно здоровых женщин, не имеющих данный генотип [6].

Интерпретация RR проводилась следующим образом: RR = 1 – отсутствие ассоциации между наличием ОНП и вероятностью наступления исхода, то есть развития БАС; RR > 1 – наличие положительной корреляции (увеличение риска развития БАС); RR < 1 – наличие отрицательной корреляции (снижение риска развития БАС).

Для идентификации и описания эпистатических взаимодействий между исследуемыми генами применялся метод многофакторного уменьшения размерности (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR) с использованием программного обеспечения MDR 3.0.2, основанный на принципе комбинаторного разбиения и редукции данных для анализа количественных признаков [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ частотного распределения полиморфных вариантов в исследуемых группах (беременные с гестационными осложнениями и контрольная группа) не выявил статистически значимых различий (p > 0,05) (табл. 1).

В то же время следует отметить высокую частоту встречаемости полиморфизмов как у беременных с БАС, так и в контрольной группе. Количество выявленных полиморфизмов варьировало от 1 до 8 (рис. 1), при этом у 81 (62,8 %) женщины с БАС было идентифицировано 5 и более ОНП. Наиболее часто встречающимся вариантом полиморфизма в обеих группах являлся MTRR: 66A/Г.

Несмотря на то что носительство полиморфизма в гене протромбина (F2: 20210Г/A) и мутации Лейдена (F5: 1691Г/A) часто ассоциируют с развитием гестационных осложнений и тромбозов [8][9], результаты настоящего исследования продемонстрировали крайне низкую частоту данных полиморфных вариантов в обеих группах (< 6 % в основной, < 3 % в контрольной) (рис. 2), что соответствует данным, представленным в ряде других публикаций [10].

Мутация гена F13: 103Г/Т была обнаружена у 32,56 % беременных женщин с БАС и 41,18 % женщин контрольной группы (рис. 3). Результаты оценки относительного риска (RR) также показали, что вероятность развития БАС коррелирует с наличием нормального гомозиготного варианта 103ГГ (RR > 1). Последнее подтверждает протективную роль генотипа F13: 103Г/Т в отношении акушерских патологий, реализуемую посредством снижения активности фактора XIII и формирования фибриновых сгустков с меньшей плотностью [11].

При анализе частоты распространения аллелей гена ITGA2 было установлено, что среди беременных с осложненным течением гестации частота встречаемости гетерозиготной формы была зафиксирована на уровне 50,39 %, а гомозиготной – 15,5 %. В контрольной группе аналогичные показатели составили 40,34 и 13,45 % соответственно, однако статистически значимых различий между группами выявлено не было (p > 0,05). Соответственно, нормальный аллельный вариант Ц/Ц гена ITGA2 демонстрировал большую представленность в генотипе женщин контрольной группы по сравнению с группой женщин с акушерскими синдромами (рис. 4), что согласуется с литературными данными [10].

Несмотря на отсутствие статистически значимых результатов, наблюдалась повышенная частота 4Г/4Г полиморфного аллеля гена SERPINE1 (ингибитор активатора плазминогена 1-го типа – 675 5Г/4Г), отвечающего за подавление фибринолиза, в группе женщин с осложнениями беременности по сравнению с контролем (30,23 и 21,01 % соответственно) (рис. 5). Однако в гетерозиготном варианте полиморфизм SERPINE1: 675 5Г/4Г чаще встречался в группе контроля (55,46 относительно 44,96 %).

Частота встречаемости генотипов AГ и ГГ полиморфизма MTR: 2756 была соизмерима в группах женщин с гестационными осложнениями и в группе сравнения (p > 0,05) и составляла 40,31 и 50,42 % соответственно (рис. 6).

Очевидно, что наличие отдельных полиморфных аллелей не является достаточным условием для развития осложнений беременности. В связи с этим для оценки воздействия различных сочетаний исследуемых полиморфизмов на возникновение акушерско-гинекологических осложнений был проведен анализ межгенных взаимодействий.

Среди 12 комбинаций с минимальной ошибкой классификации в обучающей и тестовой выборках было отобрано 3 модели (табл. 2).

1. Двухлокусная – ITGA2: 807Ц/T + SERPINE1: –6755Г/4Г.
2. Трехлокусная – F13: 103Г/T + SERPINE1: –6755Г/4Г + MTHFR: 677Ц/T.
3. Четырехлокусная – F13: 103Г/T + SERPINE1: –6755Г/4Г + MTHFR: 677Ц/T + MTHFR: 1298A/Ц.

Наиболее близкой к достоверной оказалась четырехлокусная модель: F13: 103Г/Т + SERPINE1: –6755Г/4Г + MTHFR: 677Ц/T + MTHFR: 1298A/Ц (рис. 7).

Данная комбинация характеризуется точностью предсказания 95 % и согласованностью перекрестной проверки 6/10. Между исследуемыми локусами был выявлен выраженный синергизм (рис. 8).

Построенный граф демонстрирует комбинации генотипов в рамках модели взаимодействия пяти локусов с наибольшей силой воздействия: ITGA2 – 1,12 %; SERPINE1 – 1,01 %; F13 – 0,6 %; MTHFR677 – 0,36 %; MTHFR1298 – 0,25 %. Наиболее выраженный синергизм отмечен в парах MTHFR677 – ITGA2 (1,5 %), MTHFR677 – SERPINE1 (1,32 %), MTHFR677 – F13 (1,13 %). Несмотря на относительно низкую самостоятельную значимость локуса MTHFR: 677Ц/Т (0,36 %), его присутствие в каждой из указанных пар подчеркивает способность ОНП потенцировать эффекты друг друга.

Учитывая полученные результаты, можно сделать вывод о том, что комплексный анализ полиморфизмов, затрагивающих различные патогенетические механизмы мультифакториальных заболеваний, демонстрирует большую прогностическую ценность по сравнению с однофакторным подходом, обеспечивая учет сложной генетической архитектуры генотип-фенотипических связей. В перспективе подобные прогностические модели могут быть расширены за счет включения более широкой панели генетических маркеров (ОНП), клинико-анамнестических данных и факторов внешней среды, что позволит оценивать индивидуальную предрасположенность к акушерско-гинекологической патологии на любом этапе консультирования женщины.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного генотипирования исследуемой когорты беременных женщин с большими акушерскими синдромами и группы контроля выявили широкий спектр аллельных комбинаций по исследуемым полиморфным локусам, за исключением гомозиготного варианта 20210АА гена F2, который не был обнаружен ни в одной из групп. Определение частоты встречаемости отдельных полиморфизмов в исследуемых группах установило преобладание генетических вариантов генов ITGA2 (65,89 %), SERPINE1 (75,19 %) и MTRR: 66А/Г (79,07 %) в группе БАС, тогда как в контрольной группе доминировали полиморфизмы генов SERPINE1 (76,47 %) и MTRR: 66А/Г (78,99 %). Оценка относительного риска показала, что наличие полиморфных вариантов генов, кодирующих факторы свертывания (F2, F5, F7, FGB), тромбоцитарные рецепторы (ITGA2, ITGB3), а также ферменты фолатного цикла (MTHFR677, MTRR66), ассоциировано с повышенной вероятностью развития БАС (RR > 1). Кроме того, методом многофакторного уменьшения размерности построена четырехлокусная модель синергичного взаимодействия однонуклеотидных полиморфизмов F13 (103Г/Т) + SERPINE1 (–67555Г/4Г) + MTHFR (677Ц/T) + MTHFR (1298A/Ц), что указывает на их взаимосвязанное влияние на риск развития акушерских патологий. Полученные данные подчеркивают комплексный характер генетической предрасположенности к БАС и обосновывают перспективность дальнейших исследований, направленных на выявление и валидацию прогностических моделей, интегрирующих генетические маркеры и клинические факторы риска для оптимизации профилактики и персонализированного ведения беременности.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.