СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХЛОРИДА ЛИТИЯ В ДОЗЕ 63 И 21 МИЛЛИГРАММ НА КИЛОГРАММ ЧЕРЕЗ 60 И 180 МИНУТ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЧЕРЕПНО‑МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ

ВВЕДЕНИЕ

Травматическое повреждение головного мозга является главной причиной смертельных исходов и наступления инвалидности, влекущей за собой значительные физические, социальные и экономические последствия. К известным причинам черепно-мозговой травмы (ЧМТ) относят травмоопасные виды спорта, бытовой и производственный травматизм, падения с высоты, преступность и дорожно-транспортные происшествия.

По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний в США (the United States Center for Disease Control, https://www.cdc.gov) от 3 до 5 млн человек являются инвалидами вследствие ЧМТ, которая привела к расстройству опорно-двигательного аппарата и неврологическим последствиям (деменция, энцефалопатия, эпилепсия) [1]. Каждый год в России регистрируется более 500 тыс. различных травм головного мозга, при этом около 50 тыс. людей умирают. Посттравматические неврологические нарушения, непосредственно вызвавшие инвалидность, имеют более 2 млн человек в нашей стране [2].

Более 200 лет ведущие ученые работают над концепцией патогенеза ЧМТ: молекулярная теория сотрясения и градиента давления предложена J. Petit (1774) и T. Kocher (1880), теория инерционного внутричерепного смещения и кавитационного повреждения мозга описана W. Russel (1932) и A. Gross (1958), теория деформации и ликворного удара – А. Hirsch и Е. Flamm (1966), а также Н. Duret (1978). Приведенный выше перечень подтверждает трудность в выборе вектора при описании вариабельности патофизиологических процессов травматического повреждения головного мозга.

Принято считать, что к первичным повреждениям при ЧМТ относят сотрясение и контузию, переломы черепа, рваные раны, размозжение мозга, диффузное аксональное повреждение, разрыв ствола мозга и проникающие ранения. Время соударения занимает около 100 мс, при этом чем оно меньше, тем больше травматической энергии передается головному мозгу и тем более фатальный объем травмы. Вторичные повреждения мозга имеют отсроченный характер и включают в себя дисрегуляцию мозгового кровообращения, эксайтотоксичность глутамата, оксидантный стресс, анаэробный метаболизм и митохондриальную дисфункцию, отек мозга, повреждение ДНК, некроз и апоптоз.

Отсутствие унифицированных стандартов терапии ЧМТ подчеркивает необходимость поиска надежных биомаркеров, позволяющих повысить точность диагностики и прогнозирования исходов. Крупные международные программы CENTER-TBI и TRACK-TBI убедительно показали, что концентрации ряда белков – глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), убиквитин-С-терминальной гидролазы-L1 (UCH-L1), кальций-связывающего белка S100B и нейрофиламентного легкого полипептида (NF-L) – отражают степень структурного повреждения и тесно связаны с клиническим течением заболевания [3][4]. Эти маркеры рассматриваются не только как диагностические индикаторы, но и как перспективные инструменты стратификации пациентов по риску неблагоприятного исхода. Их внедрение открывает возможности для персонализированного подхода к ведению больных с ЧМТ, включая выбор оптимальной тактики интенсивной терапии и прогнозирование долгосрочного восстановления.

Нейропротекция – способность нейронов к адаптации в экстремальных условиях для сохранения клеточной структуры и базовых функций мозга. Хлорид лития является перспективным препаратом, обладающим органопротекторными свойствами в экспериментальных условиях [5–7]. Известны подтвержденные данные о влиянии лития на ключевые звенья вторичных повреждений головного мозга, таких как нейротрофический фактор мозга, фермент гликоген-синтаза киназа-3, провоспалительные цитокины, мишень рапамицина млекопитающих и др. [8–11].

По данным работ О. А. Гребенчикова и Р. А. Черпакова установлено, что применение хлорида лития (21 мг/кг и 63 мг/кг) при моделировании фокальной ишемии у лабораторных животных уменьшает перифокальный отек и зону инсульта [12].

Существующие экспериментальные данные о действии солей лития при ЧМТ пока немногочисленны, однако они в целом подтверждают предположение о наличии выраженного нейропротекторного потенциала. При этом следует отметить, что большинство проведенных работ основывалось на доклинических протоколах с введением препарата до моделирования травмы, что искусственно усиливает протективный эффект и ограничивает экстраполяцию результатов на клиническую практику. В реальных условиях повреждение головного мозга возникает внезапно, поэтому наиболее значимой представляется оценка эффективности лития при его отсроченном применении. Такой подход ближе к клиническим сценариям и позволяет судить о возможности использования препарата как терапевтического средства, а не только как средства превентивной защиты [13].

Цель – сравнение эффективности действия хлорида лития в дозе 63 и 21 мг/кг через 60 и 180 минут после экспериментального моделирования открытой черепно-мозговой травмы у крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включены крысы линии Вистар весом 250–350 г (n = 60) и разделены на 6 групп.

1. Ложнооперированные животные, которым проводили анестезию и подготовительные мероприятия с наложением фрезевого отверстия (название – ЛО, n= 10).
2. Контрольная группа животных, которым после моделирования открытой черепно-мозговой травмы (ОЧМТ) вводился 0,9 % раствор хлорида натрия (название – Контроль, n= 10).
3. Животные, которым через 60 мин после моделирования ОЧМТ внутривенно вводился раствор хлорид лития 4,2 % в дозе 63 мг/кг (название – ОЧМТ+Литий 60 мин/63 мг, n= 10).
4. Животные, которым через 60 мин после моделирования ОЧМТ внутривенно вводился раствор хлорид лития 4,2 % в дозе 21 мг/кг (название – ОЧМТ+Литий 60 мин/21 мг, n= 10).
5. Животные, которым через 180 мин после моделирования ОЧМТ внутривенно вводился раствор хлорид лития 4,2 % в дозе 63 мг/кг (название – ОЧМТ+Литий 180 мин/63 мг, n= 10).
6. Животные, которым через 180 мин после моделирования ОЧМТ внутривенно вводился раствор хлорид лития 4,2 % в дозе 21 мг/кг (название – ОЧМТ+Литий 180 мин/21 мг, n= 10).

Экспериментальное моделирование ОЧМТ выполнялось по методу дозированного контузионного повреждения открытого мозга [1][2].

Этапы экспериментального исследования:

Подготовка операционного поля: кожа на голове крысы выбривалась и обрабатывалась антисептиком (хлоргексидин 0,05 %). Для подготовки к хирургическому доступу крысу размещали в стереотаксической раме, голову фиксировали и выполняли разрез кожи. Для воспроизведения модели ОЧМТ выполняли трепанацию в проекции сенсомоторной коры левого полушария. Хирургический доступ осуществляли с использованием микрофрезы диаметром 5 мм, формируя отверстие на границе теменной и лобной костей. Локализация операционного окна определялась по стандартным стереотаксическим координатам: 2,5 мм латерально от сагиттального шва и 1,5 мм каудально относительно брегмы. Для нанесения травмы применялся боек массой 50 г, который фиксировали в установке и располагали строго перпендикулярно к поверхности твердой мозговой оболочки на высоте 10 см, что обеспечивало контролируемое воздействие с воспроизводимым уровнем кинетической энергии.

По завершении травмирующего воздействия мягкие ткани ушивались послойно с использованием рассасывающегося шовного материала (Vicril 4–0), после чего операционное поле обрабатывалось 5 % раствором бриллиантового зеленого. В раннем посттравматическом периоде особое внимание уделялось поддержанию стабильной температуры тела животных (37 ± 0,5 °C), что достигалось применением электрической подогреваемой платформы.

Для оценки отдаленных последствий ЧМТ на 14-е сутки проводили магнитно-резонансную томографию (МРТ) головного мозга. Исследование выполняли на высокопольном томографе (BioSpec 70:30, Bruker, Германия) с напряженностью магнитного поля 7 Т и системой градиентов мощностью 105 мТл/м. В качестве анестетика использовали изофлуран (1,5–2 об. %), позволяющий поддерживать стабильный наркоз в течение всего исследования.

Протокол МРТ включал получение Т2-взвешенных изображений. Для передачи радиочастотных импульсов использовалась линейная катушка диаметром 72 мм, а регистрация сигнала осуществлялась с помощью специализированной поверхностной приемной катушки, предназначенной для работы с мозгом мелких животных. Применялась импульсная последовательность RARE (rapid imaging with refocused echoes), основанная на методике спин-эхо, с параметрами: TR – 6 000 мс, TE – 63,9 мс, толщина среза – 0,8 мм при межсрезовом интервале 0,8 мм; матрица реконструкции составляла 256 × 384, что обеспечивало пространственное разрешение 0,164 × 0,164 мм/пиксель. Средняя продолжительность сканирования одного животного составляла около 25 мин.

Весь эксперимент выполнен в соответствии с Европейской конвенцией ETS № 123 о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в научных целях (Страсбург) от 18.03.1986 с приложением от 15.06.2006; Международным соглашением о гуманном обращении с животными от 24.11.1986; Guide for the care and use of laboratory animals, 8th edition (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, 2010 г.); Directive 2010/63/EUof the European parliament and of the council on the protection of animals used for scientific purposes от 22.09.2010; «Правилами надлежащей лабораторной практики», утвержденными приказом Министерства здравоохранения России от 01.04.2016 № 199н.

Морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием пакета ImageJ (NIH, Bethesda, США). Определяли площадь повреждения на срезе с максимальным объемом очага, дополнительно анализируя четыре соседних уровня (два выше и два ниже центрального). Итоговый объем зоны повреждения вычисляли по планиметрической формуле V = ΣS_n × d, где d – толщина среза (0,8 мм), ΣS_n – суммарная площадь очага на пяти выбранных уровнях. Такой подход позволял повысить точность оценки объема повреждения и минимизировать влияние артефактов, связанных с неоднородностью сигнала.

При статистическом анализе полученных данных мы применяли следующие критерии и тесты: точный тест Фишера, критерий Шапиро – Уилка, U-критерий Манна – Уитни, критерий χ² Пирсона, тест Крускала – Уоллиса с множественными сравнениями Данна. Результаты, приведенные в исследовании, представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей [Q1, Q3]. Статистические вычисления проводились на платформах IBM SPSS Statistics и GraphPad Prizm.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Хлорид лития – препарат, обладающий протективными свойствами. По данным исследований, он является ингибитором ГСК-3β, вызывая антиапоптотические эффекты. Литий предотвращает гибель клеток от окислительного стресса, доказаны его кардиопротекторные свойства на экспериментальной модели инфаркта миокарда in vivo и нейропротекторные эффекты на модели ишемического инсульта у крыс. Полученные данные позволяют утверждать, что литий способен модулировать ключевые звенья патогенеза повреждения центральной нервной системы, включая процессы эксайтотоксичности, окислительного стресса и апоптотической гибели клеток, что в совокупности приводит к снижению выраженности структурного и функционального ущерба.

Для верификации нейропротекторного действия хлорида лития в эксперименте была использована воспроизводимая модель ОЧМТ у крыс. Выбор данной модели обусловлен ее близостью к клиническим условиям, а также наличием гипотезы о том, что соли лития способны проявлять защитные свойства даже в условиях тяжелого повреждения нервной ткани.

Оценку степени церебрального повреждения проводили на 14-е сутки после нанесения травмы, что соответствует периоду стабилизации посттравматических изменений и позволяет объективно оценить долгосрочный эффект терапии. Для этого использовали морфометрический анализ МРТ-изображений, включавший измерение объема повреждения в трех группах: ложнооперированных животных (n = 10), контрольных после ЧМТ (n = 10) и опытной группы с введением хлорида лития в дозе 63 мг/кг через 60 мин после травмы (n = 10).

Сравнительный анализ томографических данных показал, что в группе, получавшей литий, объем повреждения головного мозга был достоверно ниже, чем в контрольной. Так, медианное значение данного показателя составило 20,5 мм ³ против 35,0 мм ³ в контроле, что подтверждает выраженный нейропротективный потенциал препарата при раннем отсроченном введении (рис. 1, табл. 1). 

При изучении объема повреждения головного мозга крыс после ОЧМТ при введении хлорида лития в дозе 21 мг/кг через 60 мин проведено исследование объема повреждения головного мозга по данным морфометрического анализа МР-изображений в группах ложнооперированных животных (n = 10), группе Контроль (n = 10) и ОЧМТ+Литий 60 мин/21 мг (n = 10).

При анализе данных МРТ выявлено, что средний объем повреждения головного мозга крыс был статистически значимо меньше в группе ОЧМТ+Литий 60 мин/21 мг, чем в группе Контроль. По данным МРТ, исследуемый показатель в группах сравнения составил 25,5 mm³ и 35,0 mm³ соответственно (рис. 2, табл. 2). 

При изучении объема повреждения головного мозга крыс после ОЧМТ при введении хлорида лития в дозе 63 мг/кг через 180 мин проведено исследование объема повреждения головного мозга крыс по данным морфометрического анализа МР-изо­бражений в группах ложнооперированных животных (n = 10), группе Контроль (n = 10) и ОЧМТ+Литий 180 мин/63 мг (n = 10).

Анализируя полученные данные, мы выявили, что средний объем повреждения головного мозга крыс был статистически значимо меньше в группе ОЧМТ+Литий 180 мин/63 мг, чем в группе Контроль. По данным МРТ, исследуемый показатель в группах сравнения составил 28,0 и 35,0 mm³ соответственно (рис. 3, табл. 3).

Исследование объема повреждения головного мозга проводили по данным морфометрического анализа МР-томографических изображений в группах ложнооперированных животных (n = 10), контрольных (n =10) и группе ОЧМТ+Литий 180 мин/21 мг (n = 10).

Анализ полученных данных выявил статистически незначимые различия в исследуемых группах: средний объем церебральных повреждений в группе ОЧМТ+Литий 180 мин/21 мг был меньше, чем в контрольной группе и составил 31,5 и 35,0 mm³ соответственно (рис. 4, табл. 4). 

На основании полученных данных можно утверждать, что применение методики терапии хлоридом лития (4,2 % раствор в/в в дозе 21 мг/кг) через 180 мин после моделирования ОЧМТ у крыс линии Вистар снижает объем повреждения головного мозга крыс на 10 %.

В исследовании Фэншань Юй и соавт. на модели ЧМТ у мышей применяли хлорид лития через 15 мин после травмы. Были получены сопоставимые данные. Однако в отличие от нашего исследования, где хлорид лития применялся в дозе 0,5 и 1,5 ммоль/л (63 и 21 мг/кг), доза препарата в данном исследовании была в 2 раза выше. Так, литий в дозах 2,0 и 3,0 ммоль/кг значимо уменьшал объем повреждения головного мозга через 3 дня после моделирования ЧМТ [14].

В исследовании Цзу Фучжу и соавт. получены сопоставимые данные – введение лития уменьшало отек и нейродегенерацию гиппокампа, улучшало память и пространственное обучение после ЧМТ. Однако в отличие от нашего исследования, литий вводился ежедневно в течение 2 недель перед моделированием ЧМТ [15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги проведенной экспериментальной работы подтверждают, что хлорид лития способен реализовывать нейропротективный потенциал в условиях ОЧМТ. На моделях крыс было показано, что введение препарата в дозах 0,5 и 1,5 ммоль/кг способствует достоверному уменьшению объема повреждения нервной ткани, что объективно зафиксировано с использованием методов МРТ. Сопоставительный анализ различных режимов введения выявил выраженные различия: наибольшая эффективность отмечена при введении 63 мг/кг через 60 мин после нанесения травмы. В этой группе наблюдалось наиболее значимое снижение объема повреждения по сравнению с контролем, что указывает на наличие как дозозависимого, так и временезависимого характера действия лития. Таким образом, результаты подтверждают перспективность использования данного препарата в качестве потенциального нейропротективного средства, особенно в условиях ограниченного терапевтического окна, что имеет прямое значение для последующей трансляции данных в клиническую практику.