СНИЖЕНИЕ ГЕПАТОТОКСИЧНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА

ВВЕДЕНИЕ

Противоопухолевая химиотерапия, как правило, сопровождается токсическими явлениями, порой угрожающими жизни больного [1–3]. В связи с этим особую актуальность приобретает задача снижения токсичности лекарственных препаратов, обладающих антибластомной активностью, уменьшения их повреждающего влияния на здоровые ткани организма и, в частности, на печень [4][5]. В настоящее время в клинической практике широко применяются препараты на основе рекомбинантных форм гемопоэтических ростовых факторов, способных активировать регенераторные возможности организма для восстановления поврежденных тканей [6][7]. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (Г-КСФ) используется в онкологии и при лечении ряда инфекционных заболеваний, а также для активизации процессов выхода стволовых клеток из костного мозга. Введение препарата Г-КСФ, мобилизующего мезенхимальные стволовые клетки, способствует реализации их регенераторного потенциала [8][9]. До последнего времени на российском рынке присутствовали только дорогостоящие импортные препараты Г-КСФ. Наиболее известны ленограстим (Граноцит) и филграстим (Нейпоген), разрешенные для использования в онкологической практике [9]. Сейчас созданы отечественные препараты, в частности иммобилизированный ГКСФ, по своей активности не уступающий зарубежным аналогам.

В настоящей работе изучалась возможность коррекции побочного действия противоопухолевых препаратов на печень экспериментальных животных. При введении цитостатиков цисплатина и фарморубицина в максимально переносимой дозе (МПД) наблюдались отклонения лабораторных показателей от нормального уровня. Нами изучена возможность снижения токсического действия противоопухолевых препаратов на печень крыс с использованием препарата имГ-КСФ, который проявлял в эксперименте гепатопротективную активность [10–12]. В качестве референсного агента применяли нейпоген, препарат негликолизированного Г-КСФ человека (филграстим) (Швейцария).

Цель – исследование возможности снижения токсического действия препаратов, используемых в онкологической практике, на печень экспериментальных животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 100 белых аутбредных крысах-самках в возрасте 2,5 месяца массой 150–250 г. [13]. Содержание животных согласовано с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Для создания модели токсического поражения печени антибластомными препаратами в ходе химиотерапевтического лечения были использованы: цисплатин (Сisplatin-Teva, «ТЕВА Фармацевтические предприятия Лтд», Израиль), препарат, содержащий платину и препарат растительного происхождения; фарморубицин (Epirubicin, «Пфайзер Италия С. р.л.», Италия), противоопухолевый антибиотик. Для коррекции выявленных нарушений применен имГ-КСФ, препарат отечественного производства, произведенный ООО «Саентифик фьючер менеджмент» (г. Новосибирск, Россия) путем конъюгации молекул негликозилированного цитокина с полиэтиленгликолем молекулярной массы 1 500 Да с помощью электронно-лучевого синтеза. В качестве препарата сравнения применен нейпоген (Neupogen vial, Filgrastim, «Ф. Хоффманн – Ля Рош Лтд», Швейцария), представляющий собой форму рекомбинантной ДНК природного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Цитостатики цисплатин и фарморубицин вводили однократно внутривенно. МПД для цисплатина и фарморубицина рассчитывали методом графического пробит-анализа [14], МПД (доза, вызывающая 5 % летальность) составила для цисплатина 4 мг/кг, для фарморубицина – 5 мг/кг. Контрольные животные (n = 50) получали эквиобъемное количество растворителя. Нейпоген и имГ-КСФ вводили подкожно на второй день после введения цитостатиков курсом 5 дней в дозе 100 мкг/кг. На 2, 5, 10, 15 и 20-е сутки после инъекций цитостатиков определяли активность в сыворотке крови крыс аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) по стандартным методикам, используя полуавтоматический биохимический анализатор Согmау, наборы фирм Согmау и «Вектор Бест» [15]. Для патоморфологического исследования образцы печени помещали в фиксатор Карнуа. Морфометрический анализ площади воспалительной инфильтрации печеночной ткани, подсчет количества двуядерных и гепатоцитов с пикнотизированными ядрами проводили на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином с помощью компьютерной программы ImageJ. Для оценки накопления гликогена в печени использовали гистохимическую окраску по Мак-Манусу [16][17].

Статистическую обработку материала проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна – Уитни (программа статистического анализа StatPlus Pro (AnalystSoft Inc.) Версия 5.9) [18].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение противоопухолевых препаратов неизменно вызывает токсические реакции в организме экспериментальных животных. На рис. 1 показано возрастание активности печеночных ферментов в ответ на введение цисплатина и фарморубицина. Активность АлАТ повышалась на 2, 10 и 15-е сутки наблюдения, АсАТ – на 5-е сутки, ЩФ – на 2, 5, 10, 15, 20-е сутки, ГГТ – на 2, 5, 15 и 20-е сутки после применения цисплатина. После использования фарморубицина наблюдалось повышение уровня АлАТ на 2, 10 и 20-е сутки наблюдения, АсАТ – на 5 и 10-е сутки, ЩФ – на 10, 20-е сутки, ГГТ – во все сроки эксперимента (рис. 1, А–Г). 

Оценка активности аминотрансфераз, как известно, доминирует в ферментодиагностике патологии печени. Возросший уровень активности в сыворотке крови АлАТ свидетельствует о повышении проницаемости плазматических мембран гепатоцитов, а также о деструкции клеток печени и субклеточных образований под влиянием токсического агента. Степень подъема активности аминотрансфераз свидетельствует о выраженности цитолитического синдрома [19]. Реактивные изменения эпителия желчевыводящих путей, явления внутрипеченочного холестаза отражают активность ГГТ [19]. Для коррекции выявленных нарушений животные получали курс инъекций препарата имГ-КСФ или нейпогена соответственно.

После введения нейпогена на фоне действия цисплатина отмечен эффект коррекции токсичности цитостатика: активность АлАТ снижалась на 5, 10 и 20-е сутки, АсАТ – во все сроки опыта, ГГТ – на 2, 10, 15 и 20-е сутки. Величина активности ЩФ на 10-е сутки была ниже, чем у животных, получавших цисплатин. Использование им-ГКСФ также приводило к нормализации ферментативных показателей. Так, у животных, получавших препарат имГ-КСФ после цисплатина, отмечено уменьшение активности АлАТ до уровня контрольных показателей на 5, 10 и 20-е сутки, АсАТ – на 5 и 10-е сутки, ЩФ – на 20-е сутки, ГГТ – во все сроки опыта. Следует отметить, что на 5-е сутки исследования после действия имГ-КСФ все ферментные показатели были достоверно ниже, чем в группе животных, получавших только инъекции цисплатина (рис. 1).

При использовании рекомбинантных форм ГКСФ также уменьшалось токсическое действие фарморубицина на печень экспериментальных животных. Применение имГ-КСФ значительно улучшало показатели АлАТ и АсАТ практически во все сроки исследования, ЩФ – на 20-е сутки, ГГТ – на 15 и 20-е сутки. У крыс, получавших в качестве корректора нейпоген, уменьшалась активность АлАТ и АсАТ (10-е сутки); активность ЩФ, ГГТ снижалась на 15 и 20-е сутки опыта. Также отмечены статистически значимые различия уровня активности ферментов между группами животных, получавших только цитостатик и получавших фарморубицин и корректоры. На 10-е сутки наблюдения такие различия отмечены для АлАТ и АсАТ (фарморубицин+нейпоген) и для АсАТ и ЩФ (фарморубицин+имГ-КСФ) (рис. 2). 

В результате гистологического исследования было выявлено, что у крыс после парентерального введения фарморубицина и цисплатина развивалось токсическое повреждение паренхимы печени, протекающее по типу острого гепатита. Отмечались гиперемия сосудов, дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, воспалительная инфильтрация паренхимы печени.

В печени крыс после инъекций цисплатина и фарморубицина обнаруживались гепатоциты с пикнотизированными ядрами. Увеличение их количества фиксировалось преимущественно со 2-х по 15-е сутки и характеризовало высокую интенсивность деструктивных процессов в паренхиме печени. Данный факт подтверждался нарастанием активности АлТ, АсТ в сыворотке крови крыс в этот период нарастала [19]. В группе животных, получавших цисплатин, количество некротизированных гепатоцитов достигало максимальных значений на 5–10-е сутки эксперимента и нормализовалось к 20-м суткам. При введении фарморубицина данный показатель был наиболее высоким на 10-е сутки и не снижался до контрольных значений до конца наблюдения. В участках некроза наблюдались скопления воспалительных клеток, представленные преимущественно лимфомакрофагальными элементами. Степень инфильтрации была наиболее высокой на 5-е сутки после введения фарморубицина и на 10-е сутки после введения цисплатина – период максимально выраженных изменений, что свидетельствовало об интенсивном воспалительном процессе в паренхиме печени [20]. Отмечено также нарушение регенераторных процессов, о чем можно было судить по снижению количества двуядерных гепатоцитов со 2-х по 10-е сутки при введении цисплатина, тогда как при введении фарморубицина данный показатель не восстанавливался до конца наблюдения. Введение фарморубицина и цисплатина в МПД приводило к развитию метаболических нарушений в печени крыс. Качественное гистохимическое исследование печеночной ткани выявило исчезновение зернистой фракции гликогена из цитоплазмы гепатоцитов животных, получавших противоопухолевые препараты со 2-х по 15-е сутки.

ИмГ-КСФ и нейпоген использованы как корректоры токсического действия цисплатина и фарморубицина на морфофункциональное состояние печени крыс. В группе животных, получавших фарморубицин, введение рекомбинантных препаратов приводило к значительному снижению количества гепатоцитов с некрозом начиная с 5-х суток, а в группе с цисплатином – с 10-х суток эксперимента. Применение препаратов имГ-КСФ уменьшало выраженность воспалительной инфильтрации паренхимы печени крыс, вызывало увеличение количества двуядерных гепатоцитов у крыс, получавших корректоры с 10-х суток в группе с цисплатином и с 15-х суток в группе с фарморубицином, что свидетельствовало о развитии регенераторных процессов в печени животных.

Таким образом, после однократного введения фарморубицина и цисплатина в МПД в печени крыс развивался острый токсический гепатит. Использование имГ-КСФ и нейпогена уменьшало гепатотоксичность цисплатина и фарморубицина, стимулировало регенерацию ткани печени. По ряду определяемых показателей им-ГКСФ даже превосходил нейпоген, в частности, в более ранние сроки отмечено восстановление морфологического состояния печени крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Однократное введение в максимально переносимой дозе противоопухолевых препаратов цисплатина (4 мг/кг, внутривенно) и фарморубицина (5 мг/кг, внутривенно) вызывало значительные нарушения метаболизма в печени крыс: статистически значимое повышение активности ферментов (аминотрансфераз, ГГТ). Морфологические исследования выявили изменения, характерные для токсического гепатита, наиболее выраженные на 5, 10-е сутки после введения препарата и сохраняющиеся до 30-х суток эксперимента.

Применение им-ГКСФ в эксперименте выявило эффект снижения гепатотоксического действия антибластомных препаратов. При использовании имГКСФ пятикратно подкожно в дозе 100 мкг/кг у крыс, которым были введены цисплатин и фарморубицин в максимально переносимой дозе, значения активности печеночных ферментов стремились к норме, а патоморфологическое изучение ткани печени показало нарастание процессов восстановления гепатоцитов.