Болезнь Вильсона – Коновалова (БВК) является редким моногенным заболеванием, наследуемым по аутосомно-рецессивному типу. Болезнь преимущественно проявляется в молодом возрасте и характеризуется избыточным накоплением меди в организме. В основе патогенеза лежат мутации в гене ATP7B, локализованном на 13-й хромосоме. Впервые заболевание описано английским невропатологом – А. К. Вильсоном в 1912 г. и названо им «гепатолентикулярная дегенерация». Более детально данный патологический синдром был описан в 1960 г. Н. В. Коноваловым под названием «гепатоцеребральная дистрофия» [1]. Распространенность этого заболевания в разных регионах мира составляет в среднем 1:30 000 населения. Частота БВК выше в регионах, где распространены близкородственные браки [2]. Заболевание чаще встречается у мужчин, нежели женщин (4:1). Болезнь манифестирует в возрасте 8–16 лет, однако неврологические симптомы появляются только к 19–20 годам [3].

Клиническая картина БВК может быть весьма вариабельной при манифестации, что сильно затрудняет диагностику и может стать препятствием для назначения своевременного лечения. Самым достоверным на сегодня методом диагностики БВК является генетическое тестирование пробанда или родственников, так как данным способом она может быть выявлена даже у лиц на предсимптоматической стадии или с бессимптомным течением. Рекомендуется проводить генетическую диагностику с методом секвенирования по Сэнгеру, который позволяет обнаруживать различные варианты генных нарушений – делеции, вставки, а также миссенс-, нонсенс-варианты, а также варианты в сайтах сплайсинга. Диагноз «болезнь Вильсона – Коновалова» может быть установлен у пациента, у которого в результате молекулярно-генетического тестирования выявлены два патогенных (или вероятно патогенных) варианта в гене ATP7B [4].

Несмотря на то что большинство мутаций гена ATP7B встречаются с низкой частотой и расположены в разных частях гена, у каждой популяции и этнической группы есть свои наиболее часто встречающиеся патогенные варианты. Так, для азиатского региона (Китай, Южная Корея, Япония) наиболее характерна мутация p.Arg778Leu (c.2333G>T), ее доля составляет 14–49 % [5]. В Сардинии основной причиной БВК является делеция в промоторной области –441/–427del, которую содержали 92 % хромосом в выборке пациентов с данным диагнозом [6]. В странах Латинской Америки самой частой является мутация p.Ala1135Glnfs (c.3402delC) наряду с патогенным вариантом p.His1069Gln (с. 3207 С>А) [7]. В странах Северной Америки, Центральной и Восточной Европы, в частности в России, патогенный вариант p.His1069Gln (c.3207C>A) в гене ATP7B является самым распространенным [8][9]. Доля данной мутации варьирует от 30 до 72 %, в России же она составляет 50 % [8]. Также широкое распространение в Европе и России имеет инсерция c.2304insC. Этот вариант особенно часто встречается на Балканах [10]. В России, согласно исследованиям, было выявлено более 60 различных вариантов в гене АТР7В [11]. Наиболее часто встречающиеся мутации располагаются у российских пациентов на 8-м и 14-м экзонах [12]. Это соотносится с данными пилотного исследования на носительство частых наследственных патологий в рамках проекта «Семья» на базе Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта [13]. Так, носительство патогенных вариантов в гене ATP7B было выявлено у 6 женщин и 1 мужчины, являющегося супругом одной из них.

В связи с широким спектром патогенных вариантов в гене ATP7B, существующим в Российской Федерации, для внедрения диагностики БВК в рутинную лабораторную практику необходимо разработать простые в использовании и экономически доступные тест-системы. Такие решения позволят не только эффективно осуществлять диагностику данного заболевания, но и выявлять носителей генетических вариантов в рамках преконцепционного скрининга, включая группы риска по болезни Вильсона – Коновалова.

Цель – разработать и апробировать тест-систему для определения наиболее частых патогенных вариантов в гене ATP7B в российской популяции.

Работа по разработке и верификации тест-системы для молекулярно-генетической диагностики БВК проводилась на базе отдела геномной медицины Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д. О. Отта, г. Санкт-Петербург, с января по июнь 2024 г.

Для первичной верификации разработанной тест-системы были использованы образцы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), выделенной из цельной венозной крови, полученной от 8 неродственных индивидуумов популяционной группы. В исследование были включены образцы крови здоровых доноров, у которых на момент забора биоматериала отсутствовали подтвержденные наследственные и тяжелые соматические заболевания. Образцы входили в состав биоресурсной коллекции «Уникальная научная установка “Репродуктивное здоровье человека”» (USU_3076082), хранимой на базе биобанка «Генофонд» Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д. О. Отта, г. Санкт-Петербург. Все доноры подписали информированное добровольное согласие на взятие образцов биологического материала с возможностью их последующего исследования и долговременного хранения в биобанке.

Экстракция ДНК из образцов цельной крови и контроль качества. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови, используя стандартный протокол экстракции ДНК солевой/хлороформной смесью [14]. Контроль качества выделенной ДНК осуществляли путем измерения ее концентрации на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Разработка тест-системы. Разработка молекулярно-генетической тест-системы включала несколько этапов: формирование алгоритма детекции, выбор специфичных олигонуклеотидов для амлификации целевого фрагмента, подбор эндонуклеаз рестикции для определения аллеля и оптимизация цикла амплификации. Поиск интересующих нуклеотидных последовательностей фрагментов в гене ATP7B осуществлялся с помощью онлайн-баз данных Franklin by genoox и Ensembl [15][16]. Праймеры подбирали с помощью софта Oligo v.6.31 (Molecular Biology Insights, США). Оценку специфичности праймеров проводили с помощью базы данных BLAST [17]. Эндонуклеазы рестрикции подбирались по каталогу производителя (Сибэнзим, Россия). Праймеры были изготовлены на заказ компанией «Евроген» (Россия) на синтезаторах Applied Biosystems ABI 3900 (США).

Апробация тест-системы. Апробация тест-системы осуществлялась путем верификации амплификации целевых фрагментов ДНК с использованием разработанной тест-системы и условий детекции. Для этого применялся метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием по Сэнгеру. Амплификацию проводили на программируемом термоциклере C1000 Touch (Bio-Rad, США) в следующих режимах.

Начальная денатурация: 96 ºС – 240 с.

Основной цикл (37 циклов):

Отжиг праймеров: 72 ºС/60 ºС/53 ºС/63 ºС – 30 с (температура отжига для каждого подобранного праймера представлена в разделе «Результаты и их обсуждение»).

Завершающий синтез: 72 ºС – 180 с.

Продукты амплификации разделяли в 7,5 % полиакриламидном геле.

Для определения патогенных вариантов продукты ПЦР очищали 5 М ацетатом аммония, секвенировали на Genetic Analyzer 3130xl (Thermo Fisher Scientific, США) и анализировали с помощью SeqScanner Software 1.0 (Thermo Fisher Scientific, США).

В результате выполнения настоящего исследования на основе литературных источников и доступных онлайн баз данных нами были выбраны 9 патогенных вариантов в гене ATP7B, ответственных за развитие болезни Вильсона – Коновалова, с наибольшей частотой встречаемости в российской популяции (табл. 1). Была разработана тест-система для анализа данных вариантов, созданы специфичные праймеры для проведения ПЦР целевых фрагментов и выбраны эндонуклеазы рестрикции, позволяющие детектировать генные варианты. Верификация тест-системы выполнялась методом секвенирования по Сэнгеру.

Определение генотипа осуществляется с применением методов секвенирования по Сэнгеру или рестрикционного анализа. В табл. 2 представлены последовательности праймеров и эндонуклеазы рестрикции, использованные в разработанной тест-системе, а также условия проведения ПЦР.

С целью верификации тест-системы выполнялись ПЦР и оценка ряда параметров амплификации целевых фрагментов ДНК: соответствие нуклеотидной последовательности ампликона референсной последовательности, уровень эффективности амплификации. Для этого на данном этапе исследования было проведено секвенирование всех исследуемых образцов по Сэнгеру, результаты представлены на рис. 1–3.

Полученные результаты подтверждают эффективность разработанной тест-системы, что позволяет использовать ее для детекции вариантов в гене ATP7B как в диагностических, так и в научных целях.

Таким образом, проведенная работа позволила разработать и апробировать тест-систему для определения наиболее распространенных патогенных вариантов, ассоциированных с развитием БВК в российской популяции. Несмотря на то что БВК в настоящее время классифицируется как орфанное аутосомно-рецессивное заболевание, частота носительства вариантов в гене ATP7B в нашей популяции может быть недооценена. Согласно последним исследованиям, проведенным в Северо-Западном регионе в рамках пилотного проекта скрининга на носительство частых наследственных патологий, каузативные варианты в гене ATP7B были обнаружены у 7 из 214 обследованных участников, включая одну семейную пару, что, несомненно, подтверждает актуальность разработки тест-системы на данное заболевание [13]. Следует отметить, что разработанная тест-система представляет собой не только эффективный инструмент для диагностики заболевания, но и может быть интегрирована в программу преконцепционного скрининга на этапе прегравидарной подготовки.

Разработанная тест-система для молекулярно-генетической диагностики болезни Вильсона – Коновалова является эффективным инструментом для подтверждения диагноза у пациентов с уже выявленными лабораторными и клиническими признаками нарушения метаболизма меди. Использование данного лабораторного подхода позволяет проводить обследование пациентов из групп риска, например имеющих отягощенный семейный анамнез. Более того, тест-система с минимальными затратами и в сжатые сроки позволяет осуществлять скрининг носительства БВК в общей популяции в рамках преконцепционного исследования, что придает особую значимость данному решению в контексте планирования беременности.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.