Длительная алкогольная интоксикация представляет собой одну из наиболее значимых медико-социальных проблем современного здравоохранения, приводящих к стойким нарушениям когнитивных функций и развитию алкоголь-ассоциированных поражений центральной нервной системы [1]. Особую тревогу вызывает прогрессирующее нарушение процессов обучения и памяти, в основе которого лежат нейродегенеративные изменения в ключевых структурах мозга, в первую очередь в гиппокампе. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению патогенетических механизмов алкоголь-индуцированного повреждения мозга, разработка эффективных нейропротекторных стратегий остается актуальной задачей современной медицины [2–7].

Ведущая роль в патогенезе алкоголь-индуцированного повреждения нейронов принадлежит активации программируемой клеточной гибели. Многочисленные исследования демонстрируют участие как митохондриального, так и рецептор-опосредованного путей апоптоза, а также вновь открытого механизма пироптоза в повреждении нейрональных сетей гиппокампа. Однако вклад конкретных молекулярных механизмов в нарушение консолидации памяти при хронической алкогольной интоксикации требует дальнейшего изучения. Особый интерес представляет исследование каспаз-зависимых каскадов, в частности инициаторной каспазы-1, эффекторной каспазы-3, а также регуляторов митохондриального пути апоптоза (Bcl-2, Bax), поскольку их дисбаланс может быть ключевым звеном в развитии нейродегенеративных изменений [8–12].

В качестве перспективного нейропротекторного агента рассматривается моносиалотетрагексилганглиозид (далее – ганглиозид GM1) – важный компонент клеточных мембран нейронов, участвующий в процессах нейропластичности, регенерации и защиты от апоптоза. Экспериментальные данные свидетельствуют о его способности модулировать активность трофических факторов, подавлять окислительный стресс и стабилизировать мембранные структуры. Однако его влияние на апоптотические процессы и восстановление когнитивных функций изучено недостаточно [13–14].

Таким образом, целью настоящего исследования явилась комплексная оценка влияния ганглиозида GM1 на процессы обучения и памяти, а также на экспрессию ключевых регуляторов апоптоза (каспаза-1, каспаза-3, Bcl-2, Bax) в гиппокампе мышей в условиях экспериментальной длительной алкогольной интоксикации. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи.

Исследование проведено на мышах-самцах альбиносах инбредной линии BALB/c в возрасте 4–6 недель с исходной массой тела 25–30 г. Мыши содержались в стандартных условиях при естественном цикле свет/темнота, температуре воздуха 20–24 °C и относительной влажности 50–60 %. Корм и кипяченая вода предоставлялись ad libitum. Все экспериментальные процедуры выполнялись в соответствии с международными рекомендациями и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и иных научных целях. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом.

После недельной акклиматизации мыши были случайным образом распределены на четыре экспериментальные группы (n = 10 в каждой группе).

Группа I (контроль) получала эквивалентный объем 0,9 % раствора хлорида натрия через интрагастральный зонд на протяжении всего эксперимента.

Группа II (модель) подвергалась длительной интоксикации путем принудительного введения этанола.

Группа III (этанол + GM1-низкая) подвергалась длительной интоксикации этанолом и получала внутрибрюшинные инъекции ганглиозида GM1 в низкой дозе (10 мг/кг).

Группа IV (этанол + GM1-высокая) подвергалась длительной интоксикации этанолом и получала внутрибрюшинные инъекции ганглиозида GM1 в высокой дозе (30 мг/кг).

Мышам групп II, III и IV один раз в сутки принудительно вводили этанол (97 %, Shanghai Aladdin Reagent Company, Китай) в возрастающей концентрации через интрагастральный зонд по следующей схеме:

– 5 % раствор этанола в течение 5 дней;

– 15 % раствор этанола в течение 5 дней;

– 25 % раствор этанола в течение 10 дней;

– 35 % раствор этанола в течение 10 дней;

– 45 % раствор этанола в течение 17 дней.

Общая продолжительность введения этанола составила 47 дней. Объем вводимого этанола и физиологического раствора (для группы I) рассчитывали на основе массы тела с учетом концентрации раствора, что было эквивалентно 1 л на 60 кг массы тела.

Моносиалотетрагексозилганглиозид натрия для инъекций (20 мг/2 мл, Heilongjiang Harbin Medical University Pharmaceutical Co., Ltd., Китай) растворяли в физиологическом растворе для получения требуемых концентраций. Мыши группы III и IV получали внутрибрюшинные инъекции GM1 в дозах 10 и 30 мг/кг соответственно на протяжении всего периода воздействия этанола. I и II группы получали эквивалентные объемы инъекций физиологического раствора.

Формирование и сохранение аверсивной памяти оценивали с помощью теста пассивного избегания (УРПИ) на аппарате «Светлая/темная комната» (модель BA-200, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., Китай). Установка состояла из двух камер: ярко освещенной и темной, оборудованной электродным полом. Тест проводили в тихом помещении с постоянной температурой окружающей среды (22 ± 1 °C) и относительной влажностью 50–60 % согласно следующим принципам.

Обучение (фаза приобретения, 37-й день эксперимента): каждую мышь помещали в светлую камеру. После того как животное переходило в темную камеру (врожденное предпочтение), дверца закрывалась, и мышь получала легкий удар током (0,5 мА в течение 5 с) через решетчатый пол. Фиксировали исходную латентность (задержку) перехода в темную камеру.

Тестирование (фаза сохранения): сохранение памяти проверяли в два временных пункта: через 24 часа (38-й день) и через 7 дней (42-й день) после сеанса обучения. Во время каждого теста мышь снова помещали в светлую камеру и регистрировали латентность перехода в темную камеру до максимального времени наблюдения 300 секунд. Во время тестовых сессий удар током не применялся. Увеличение времени латентности во время тестов на сохранение по сравнению с фазой приобретения интерпретировалось как успешное обучение и сохранение памяти.

Эвтаназию животных проводили в соответствии с рекомендациями Федерации европейских научных ассоциаций по лабораторным животным (FELASA). После наступления глубокой наркотической комы, индуцированной внутрибрюшинным введением 1 % раствора пентобарбитала натрия, осуществляли транскардиальную перфузию. Сначала через левый желудочек вводили 20–25 мл 0,9 % раствора натрия хлорида для вымывания крови, эксфузия которой производилась через разрез в правом предсердии. Затем для фиксации тканей головного мозга проводили перфузию 4 % раствором параформальдегида (или забуференным формалином).

Для оценки влияния исследуемых агентов на экспрессию ключевых регуляторных белков в тканях гиппокампа был применен метод вестерн-блоттинга. После завершения поведенческих тестов животных эвтаназировали и выделяли ткани гиппокампа.

Клетки лизировали с использованием раствора буфера для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA буфер, Thermo, Rockford, IL, USA) с последующим центрифугированием на высокоскоростной охлаждаемой центрифуге Tomy MX-307 (20 мин, 12 000 об/мин при 4 °C). Концентрацию общего белка в полученных лизатах определяли с помощью BCA-теста: образцы инкубировали при 37,1 °C в шейкере Crystal Incubator Shaker (Китай) с добавлением реагента BCA (реагент A: 1 % бицинхониновая кислота; реагент B: 4 % сульфат меди (II); Beyotime, Китай) и измеряли оптическую плотность на сканере Epoch (Thermo, США).

Белковые образцы разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующим полусухим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Блокирование неспецифических сайтов связывания проводили в течение 1 часа в 5 % растворе обезжиренного молока DifcoTM (BD, США). Мембраны инкубировали с первичными антителами в течение 14–16 часов при 4 °C.

Использовали следующие первичные антитела производства Wanleibio Co. Ltd (Китай):

– кроличьи поликлональные антитела к каспазе-3 (WL01992a) – для детекции эффекторной каспазы-3, ключевого медиатора каспазного каскада при инициации апоптоза;

– кроличьи поликлональные антитела к каспазе-1 (WL01020) – для оценки уровня экспрессии каспазы-1, центрального белка, ответственного за инициацию пироптоза;

– кроличьи поликлональные антитела к B-кле­т­очной лимфоме-2 (далее – Bcl-2) (WL01556) – для определения экспрессии основного антиапоптотического белка Bcl-2, критического внутриклеточного регулятора апоптотического пути;

– кроличьи поликлональные антитела к Bcl-2-ассоциированному Х белку (далее – Bax) (WL01637) – для детекции проапоптотического белка Bax из семейства Bcl-2, участвующего в регуляции апоптоза.

После инкубации со вторичными флуоресцентно-мечеными антителами иммунореактивные полосы визуализировали и анализировали с помощью системы Odyssey® CLx (Li-COR, США). В качестве референсного белка использовали глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (далее – GAPDH).

Для проведения статистического анализа данных было использовано программное обеспечение GraphPad Prism v.6.0e для Macintosh (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Статистическая значимость различий между группами оценивалась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (two-way ANOVA). Проводились множественные сравнения следующих групп: группы I с группой II, а также групп III и IV с группой II. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Различия считались статистически значимыми при уровне p < 0,05.

Проведенная оценка формирования и воспроизведения аверсивной памяти в тесте условного рефлекса пассивного избегания выявила статистически значимые различия между группами. Через 24 часа после обучения было зарегистрировано достоверное уменьшение времени пребывания в светлом отсеке в II группе по сравнению с I группой, что свидетельствует о нарушении консолидации кратковременной памяти в долговременную. Данный эффект может быть связан с пагубным воздействием длительной интоксикации алкоголем на гиппокамп-структуру, играющую ключевую роль в процессах обучения и памяти.

В группах III и IV, получавших ганглиозид GM1 в обеих концентрациях (10 мг/кг и 30 мг/кг), не было обнаружено статистически значимого положительного эффекта на показатели памяти по сравнению с II группой ни через 24 часа, ни через 7 дней после обучения (рис. 1, табл. 1).

Анализ экспрессии ключевых регуляторов апоптоза в гиппокампе выявил значительные изменения под влиянием длительной интоксикации алкоголем и применения ганглиозида GM1. Уровень белка каспазы-1 был статистически значимо повышен в II группе по сравнению с I и достоверно снижен в обеих экспериментальных группах (III и IV) по сравнению с II группой. Аналогичная динамика наблюдалась для эффекторной каспазы-3, что свидетельствует об активации каспазного каскада и рецептор-зависимого пути апоптоза при хронической алкогольной интоксикации и нейропротекторном эффекте ганглиозида GM1 (рис. 2, а–б, табл. 2).

Анализ белков семейства Bcl-2 показал сложную динамику изменений. Уровень проапоптотического белка BAX был статистически значимо снижен в II группе по сравнению с I, но повышен в группе IV с высокодозовым введением ганглиозида GM1. Экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 была статистически значимо повышена в группе III с низкодозовым введением GM1 по сравнению с модельной группой. Полученные данные могут указывать на опосредованное вовлечение митохондриального пути апоптоза в условиях хронической алкогольной интоксикации (рис. 2, в–г, табл. 2).

Полученные результаты демонстрируют, что длительная интоксикация алкоголем приводит к значительным нарушениям процессов консолидации памяти, что проявляется в снижении времени пребывания в светлом отсеке через 24 часа после обучения в тесте условного рефлекса пассивного избегания. Этот эффект коррелирует с повышенной экспрессией ключевых медиаторов апоптоза – каспазы-1 и каспазы-3 – в тканях гиппокампа, что свидетельствует об активации программируемой клеточной гибели в этой критической для формирования памяти структуре.

Введение ганглиозида GM1 продемонстрировало нейропротекторный потенциал, проявляющийся в нормализации уровня исследуемых апоптотических маркеров. Статистически значимое снижение уровня каспазы-1 и каспазы-3 в группах, получавших GM1, по сравнению с модельной группой свидетельствует о подавлении активации апоптотических путей, индуцированных длительной интоксикацией алкоголем.

Было выявлено дозозависимое влияние GM1 на регуляцию белков семейства Bcl-2. Введение GM1 в дозе 10 мг/кг достоверно повышало уровень антиапоптотического белка Bcl-2. В то же время более высокая доза GM1 (30 мг/кг) оказывала выраженное влияние на проапоптотический белок ВАХ. Эти данные указывают на сложный, дозозависимый механизм нейропротекторного действия ганглиозида GM1.

Несмотря на выраженные положительные изменения на биохимическом уровне, статистически значимого улучшения поведенческих показателей под воздействием ганглиозид GM1 зафиксировано не было. Объяснением данному несоответствию между биохимическими и функциональными исходами могут служить такие факторы, как временные параметры введения препарата, ограниченная чувствительность поведенческого теста или недостаточная продолжительность постинтоксикационного периода для восстановления когнитивных функций.

Настоящее исследование демонстрирует, что длительная алкогольная интоксикация приводит к нарушениям формирования памяти, которые коррелируют с активацией апоптотических процессов в гиппокампе. Ганглиозид GM1 проявляет нейропротекторные свойства на биохимическом уровне, нормализуя экспрессию ключевых маркеров апоптоза, однако для достижения статистически значимого функционального улучшения может потребоваться оптимизация режима дозирования и продолжительности терапии.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.