surgumedВестник СурГУ. МедицинаVestnik SurGU. Meditsina2949-3447Сургутский государственный университет10.35266/2949-3447-2025-1-9surgumed-834Research ArticleМЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ. ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕLIFE SCIENCES. ORIGINAL RESEARCHМЕТОД СЕКВЕНИРОВАНИЯ И АЛГОРИТМ АНАЛИЗА ПРОФИЛЕЙ МЕТИЛИРОВАНИЯ НА ОСНОВАНИИ ДАННЫХ NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОДНОРОДИТЕЛЬСКИХ ДИСОМИЙSEQUENCING METHOD AND ALGORITHM FOR ANALYZING METHYLATION PROFILES BASED ON NGS DATA TO IDENTIFY UNIPARENTAL DISOMYhttps://orcid.org/0009-0000-7015-1208СучкоП. А.SuchkoP. A.

магистрант

 

Master`s Degree Student

https://orcid.org/0000-0002-0028-9727НекрасоваД. А.NekrasovaD. A.

 биоинформатик

Bioinformatician

https://orcid.org/0000-0003-0120-4163ДонниковМ. Ю.DonnikovM. Yu.

врач – лабораторный генетик, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник

Laboratory Geneticist, Candidate of Sciences (Medicine), Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0002-0091-2224ГлотовО. С.GlotovO. S.

доктор биологических наук, заведующий отделом экспериментальной медицинской вирусологии, молекулярной генетики и биобанкинга

Doctor of Sciences (Biology), Head of the Department of Experimental Medical Virology, Molecular Genetics and Biobanking

https://orcid.org/0000-0002-4479-3095ДаниловЛ. Г.DanilovL. G.

младший научный сотрудник

Junior Researcher

ldanilov@spbu.ruСанкт-Петербургский государственный университет, Санкт-ПетербургРоссияSaint-Peterburg State University, Saint PetersburgRussian FederationООО «Сербалаб», Санкт-ПетербургРоссияLLC “Serbalab”, Saint PetersburgRussian FederationСургутский государственный университет, СургутРоссияSurgut State University, SurgutRussian FederationДетский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург; Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта, Санкт-ПетербургРоссияPediatric Research and Clinical Center for Infectious Diseases under the Federal Medical Biological Agency; The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D. O. Ott, Saint PetersburgRussian Federation2025040420251817380Copyright © Сучко П.А., Некрасова Д.А., Донников М.Ю., Глотов О.С., Данилов Л.Г., 20252025Сучко П.А., Некрасова Д.А., Донников М.Ю., Глотов О.С., Данилов Л.Г.Suchko P.A., Nekrasova D.A., Donnikov M.Y., Glotov O.S., Danilov L.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.surgumed.ru/jour/article/view/834

Однородительская дисомия – аномалия, при которой обе гомологичные хромосомы наследуются от одного родителя. Патологические эффекты рассматриваемой аномалии связаны с нарушениями импринтинга и потерей гетерозиготности. Классические методы диагностики, такие как микросателлитный анализ и хромосомный матричный анализ, имеют ограничения при диагностике аномалии в неполных семьях и мозаичных случаях. Цель данного исследования – оценка потенциальной эффективности метода диагностики однородительских дисомий хромосом и нарушений импринтинга на основании профилирования метилирования ДНК по данным секвенирования нового поколения. В частности, был модифицирован метод пробоподготовки библиотек геномной ДНК с использованием метилзависимой эндонуклеазы GlaI в сочетании с эндонуклеазой рестрикции Bst2UI для увеличения информативности анализа, а также разработан биоин-форматический алгоритм обработки данных. Метод был протестирован на клиническом случае реципрокной транслокации (3;19)(q12;q13.3) по материнской линии с подозрением на сегментарную однородительскую дисомию у пробанда. Модификация протокола пробоподготовки позволила достичь охвата около 5 млн сайтов метилирования. Биоинформатический анализ включал определение статуса метилирования клинически значимых областей контроля импринтинга и поиск областей гомозиготности. Метод позволил охватить 2/3 потенциальных   областей контроля импринтинга. Признаков однородительской дисомии у пробанда обнаружено не было, что согласуется с результатами хромосомного матричного анализа. Несмотря на то что подход представляет собой экономически эффективную альтернативу полногеномному бисульфитному секвенированию, остаются нерешенными проблемы с нормализацией получаемых относительных уровней метилирования. В дальнейшем планируется провести валидацию разработанного на биологических образцах с подтвержденными случаями однородительской дисомии, чтобы сделать однозначный вывод о его пригодности для идентификации рассматриваемых аномалий.

Uniparental disomy is an anomaly where both homologous chromosomes are inherited from the same parent. The pathological effects of this anomaly are associated with imprinting disorders and loss of heterozygosity. Traditional diagnostic methods, such as simple sequence repeats analysis and chromosomal microarray analysis, have limitations in diagnosing the anomaly in single-parent households and mosaic cases. The aim of this study is to evaluate the potential effectiveness of a diagnostic method for uniparental disomy and imprinting disorders based on DNA methylation profiling using next-generation sequencing data. In particular, a genomic DNA bank sample preparation was modified using the methyl-dependent endonuclease GlaI in combination with the restriction endonuclease Bst2UI to improve its informativeness. In addition, bioinformatic analysis algorithm was developed. The method was tested on a clinical case of maternal reciprocal translocation (3;19)(q12;q13.3) with suspected segmental uniparental disomy in the proband. Modification of the bank sample preparation protocol provided the coverage of approximately 5 million methylation sites. Bioinformatic analysis included definition of methylation status in clinically significant imprinting control regions and the search for regions of homozygosity. The method enabled the coverage of 2/3 of potential imprinting control regions. No signs of uniparental disomy were found in the proband, which is consistent with the results of chromosomal microarray analysis. Although the approach represents a cost-effective alternative to genomewide bisulfite sequencing, problems with normalizing the relative methylation levels remain. Further validation of biologically developed method on confirmed uniparental disomy cases is planned to definitively assess itssuitability for identifying anomalies.

однородительская дисомияметилирование ДНКNGSгеномный импринтингuniparental disomyDNA methylationNGSgenomic imprintingработа выполнена при поддержке гранта №2023-569-05 Ханты-Мансийского автоном- ного округа – Югрыthe work was supported by the grant No. 2023-569-05 of Khanty-Mansi Autonomous Okrug – YugraReferencesDel Gaudio D., Shinawi M., Astbury C. et al. Diagnostic testing for uniparental disomy: a points to consider statement from the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) // Genetics in Medicine. 2020, Vol. 22, no. 7. P. 1133–1141. https://doi.org/10.103 8/s41436-020-0782-9.Del Gaudio D., Shinawi M., Astbury C. et al. Diagnostic testing for uniparental disomy: a points to consider statement from the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) // Genetics in Medicine. 2020, Vol. 22, no. 7. P. 1133–1141. https://doi.org/10.103 8/s41436-020-0782-9.Liehr T. 2025. Cases with uniparental disomy. URL: https://cs-tl.de/DB/CA/UPD/0-Start.html (дата обращения: 13.01.2025).Liehr T. 2025. Cases with uniparental disomy. URL: https://cs-tl.de/DB/CA/UPD/0-Start.html (дата обращения: 13.01.2025).Benn P. Uniparental disomy: Origin, frequency, and clinical significance // Prenatal Diagnosis. 2021. Vol. 41, no. 5. P. 564–572. https://doi.org/10.1002/pd.5837.Benn P. Uniparental disomy: Origin, frequency, and clinical significance // Prenatal Diagnosis. 2021. Vol. 41, no. 5. P. 564–572. https://doi.org/10.1002/pd.5837.Eggermann T., Soellner L., Buiting K. et al. Mosaicism and uniparental disomy in prenatal diagnosis // Trends in Molecular Medicine. 2015. Vol. 21, no. 2. P. 77–87. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2014.11.010.Eggermann T., Soellner L., Buiting K. et al. Mosaicism and uniparental disomy in prenatal diagnosis // Trends in Molecular Medicine. 2015. Vol. 21, no. 2. P. 77–87. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2014.11.010.Chien S.-C., Chen C.-P., Liou J.-D. Prenatal diagnosis and genetic counseling of uniparental disomy // Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology. 2022. Vol. 61, no. 2. P. 210–215. https://doi.org/10.1016/j.tjog.2022.02.006.Chien S.-C., Chen C.-P., Liou J.-D. Prenatal diagnosis and genetic counseling of uniparental disomy // Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology. 2022. Vol. 61, no. 2. P. 210–215. https://doi.org/10.1016/j.tjog.2022.02.006.Nakka P., Smith S. P., O’Donnell-Luria A. H. et al. Characterization of Prevalence and Health Consequences of Uniparental Disomy in Four Million Individuals from the General Population // The American Journal of Human Genetics. 2019. Vol. 105, no. 5. P. 921–932. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2019.09.016.Nakka P., Smith S. P., O’Donnell-Luria A. H. et al. Characterization of Prevalence and Health Consequences of Uniparental Disomy in Four Million Individuals from the General Population // The American Journal of Human Genetics. 2019. Vol. 105, no. 5. P. 921–932. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2019.09.016.Сhen Q., Chen Y., Shi L. et al. Uniparental disomy: expanding the clinical and molecular phenotypes of whole chromosomes // Frontiers in Genetics. 2023. Vol. 14. https://doi.org/10.3389/fgene.2023.1232059.Сhen Q., Chen Y., Shi L. et al. Uniparental disomy: expanding the clinical and molecular phenotypes of whole chromosomes // Frontiers in Genetics. 2023. Vol. 14. https://doi.org/10.3389/fgene.2023.1232059.Liehr T. Uniparental disomy (UPD) in clinical genetics: A guide for clinicians and patients. Springer, 2014. 192 p.Liehr T. Uniparental disomy (UPD) in clinical genetics: A guide for clinicians and patients. Springer, 2014. 192 p.Вашукова Е. С., Тарасенко О. А., Козюлина П. Ю. и др. Оценка эффективности полногеномного неинвазивного пренатального тестирования для выявления редких хромосомных аномалий на основе опыта ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д. О. Отта» // Медицинская генетика. 2022. Т. 21, № 11. С. 19–22.Вашукова Е. С., Тарасенко О. А., Козюлина П. Ю. и др. Оценка эффективности полногеномного неинвазивного пренатального тестирования для выявления редких хромосомных аномалий на основе опыта ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д. О. Отта» // Медицинская генетика. 2022. Т. 21, № 11. С. 19–22.Gonzales P. R., Andersen E. F., Brown T. R. et al. Interpretation and reporting of large regions of homozygosity and suspected consanguinity/uniparental disomy, 2021 revision: A technical standard of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) // Genetics of Medicine. 2022. Vol. 24, no. 2. P. 255–261. https://doi.org/10.1016/j.gim.2021.10.004.Gonzales P. R., Andersen E. F., Brown T. R. et al. Interpretation and reporting of large regions of homozygosity and suspected consanguinity/uniparental disomy, 2021 revision: A technical standard of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) // Genetics of Medicine. 2022. Vol. 24, no. 2. P. 255–261. https://doi.org/10.1016/j.gim.2021.10.004.Scuffins J., Keller-Ramey J., Dyer L. et al. Uniparental disomy in a population of 32,067 clinical exome trios // Genetics of Medicine. 2021. Vol. 23, no. 6. P. 1101–1107. https://doi.org/10.1038/s41436-020-01092-8.Scuffins J., Keller-Ramey J., Dyer L. et al. Uniparental disomy in a population of 32,067 clinical exome trios // Genetics of Medicine. 2021. Vol. 23, no. 6. P. 1101–1107. https://doi.org/10.1038/s41436-020-01092-8.Саженова Е. А., Лебедев И. Н. Стандарты молекулярно-генетической ДНК-диагностики болезней геномного импринтинга на примере синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана // Медицинская генетика. 2015. Т. 14, № 9. С. 3–10.Саженова Е. А., Лебедев И. Н. Стандарты молекулярно-генетической ДНК-диагностики болезней геномного импринтинга на примере синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана // Медицинская генетика. 2015. Т. 14, № 9. С. 3–10.Yamada M., Okuno H., Okamoto N. et al. Diagnosis of Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome by targeted nanopore longread sequencing // European Journal of Medical Genetics. 2023. Vol. 66, no. 2. https://doi.org/10.1016/j.ejmg.2022.104690.Yamada M., Okuno H., Okamoto N. et al. Diagnosis of Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome by targeted nanopore longread sequencing // European Journal of Medical Genetics. 2023. Vol. 66, no. 2. https://doi.org/10.1016/j.ejmg.2022.104690.Holthöfer L., Diederich S., Haug V. et al. A case of an Angelmansyndrome caused by an intragenic duplication of UBE3A uncovered by adaptive nanopore sequencing // Clinical Epigenetics. 2024. Vol.16. https://doi.org/10.1186/s13148-024-01711-0.Holthöfer L., Diederich S., Haug V. et al. A case of an Angelmansyndrome caused by an intragenic duplication of UBE3A uncovered by adaptive nanopore sequencing // Clinical Epigenetics. 2024. Vol.16. https://doi.org/10.1186/s13148-024-01711-0.Abdurashitov M. A., Tomilov V. N., Gonchar D. A. et al. Comparative analysis of RCGY sites methylation in three human cell lines // Epigenetic DNA diagnostics. 2019. https://doi.org/10.26213/ SE.2019.76.40116.Abdurashitov M. A., Tomilov V. N., Gonchar D. A. et al. Comparative analysis of RCGY sites methylation in three human cell lines // Epigenetic DNA diagnostics. 2019. https://doi.org/10.26213/ SE.2019.76.40116.Mora-Márquez F., García-Olivares V., Emerson B. C. et al. ddRADseqTools: a software package for in silico simulation and testing of double-digest RADseq experiments // Molecular Ecology Resources. 2017. Vol. 17, no. 2. P. 230–246. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12550.Mora-Márquez F., García-Olivares V., Emerson B. C. et al. ddRADseqTools: a software package for in silico simulation and testing of double-digest RADseq experiments // Molecular Ecology Resources. 2017. Vol. 17, no. 2. P. 230–246. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12550.Putri G. H., Anders S., Pyl P. T. et al. Analysing high-throughput sequencing data in Python with HTSeq 2.0 // Bioinformatics. 2022. Vol. 38, no. 10. P. 2943–2945. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btac166.Putri G. H., Anders S., Pyl P. T. et al. Analysing high-throughput sequencing data in Python with HTSeq 2.0 // Bioinformatics. 2022. Vol. 38, no. 10. P. 2943–2945. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btac166.A resource for integrated genetical genomic analysis of the human Imprint Control Regions (ICRs). URL: https://humanicr.org/ (дата обращения: 15.01.2025).A resource for integrated genetical genomic analysis of the human Imprint Control Regions (ICRs). URL: https://humanicr.org/ (дата обращения: 15.01.2025).Radtke M., Moch J., Hentschel, J. et al. altAFplotter: a web app for reliable UPD detection in NGS diagnostics // BMC Bioinformatics. 2024. Vol. 25. https://doi.org/10.1186/s12859-024-05922-3.Radtke M., Moch J., Hentschel, J. et al. altAFplotter: a web app for reliable UPD detection in NGS diagnostics // BMC Bioinformatics. 2024. Vol. 25. https://doi.org/10.1186/s12859-024-05922-3.Jima D. D., Skaar D. A., Planchart A. et al. Genomic map of candidate human imprint control regions: the imprintome // Epigenetics. 2022. Vol. 17, no. 13. P. 1920–1943. https://doi.org/10.1080/15592294.2022.2091815.Jima D. D., Skaar D. A., Planchart A. et al. Genomic map of candidate human imprint control regions: the imprintome // Epigenetics. 2022. Vol. 17, no. 13. P. 1920–1943. https://doi.org/10.1080/15592294.2022.2091815.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.